ПЛР (дослідження) - заявка. Що таке методика ПЛР?

ПЛР - це тест, який застосовували при діагностиці багатьох захворювань. Метод ПЛР дозволяє показати безпосередню присутність бактерій в організмі, а особливо його ДНК. ПЛР використовується, серед іншого, при діагностиці хвороби Лайма. Що таке методика ПЛР? Що таке ПЛР у реальному часі?

Зміст:

1. ПЛР (тестування) - що таке методика ПЛР?
2. ПЛР (дослідження) - застосування методу ПЛР
3. ПЛР (дослідження) - хвороба Лайма
4. ПЛР (дослідження) - результати. Чи можуть вони бути помилковими спрацьовуваннями?
5. ПЛР (дослідження) - результати. Чи можуть вони бути помилково негативними

ПЛР (полімеразна ланцюгова реакція) - основний метод, що застосовується в генетичних та молекулярних лабораторіях. Він був розроблений в 1983 році Кара Мулліс, який був удостоєний Нобелівської премії в 1993 році за нього.

Послухайте, що таке методика ПЛР. Це матеріал із циклу СЛУХАЙ ДОБРЕ. Підкасти з порадами.

Щоб переглянути це відео, увімкніть JavaScript і подумайте про оновлення до веб-браузера, що підтримує відео HTML5

ПЛР (тестування) - що таке методика ПЛР?

ПЛР-тестування складається з багаторазової ампліфікації (зазвичай у 30-40 циклів) конкретного фрагмента ДНК, наприклад, генів, що кодують білки боррелії, із застосуванням ферменту полімерази.

Потім використовуються спеціальні молекулярні барвники, щоб зробити ампліфікований фрагмент ДНК видимим. ПЛР завдяки ампліфікації конкретних фрагментів ДНК є ультрачутливим методом.

У методі ПЛР фрагменти ДНК ампліфікуються специфічними парами праймерів для даної області ДНК бактерій. Наприклад, цільовими областями в ПЛР, що використовуються для діагностики хвороби Лайма, є гени, що кодують білки, наприклад 16S рДНК, recA, fla, p66, OspA.

Біологічним матеріалом, з якого можна провести випробування, є:

• крові
• ділянка шкіри від мігруючої еритеми
• спинномозкова рідина
• синовіальна рідина або із суглобового хряща
• сеча

ПЛР (дослідження) - застосування методу ПЛР

На додаток до діагностики бореліозу Лайма за допомогою методу ПЛР можна виявити конкретні фрагменти ДНК інших мікроорганізмів або людини. Тому метод ПЛР також використовується у:

• діагностика та моніторинг вірусних інфекцій: віруси герпесу (вірус герпесу, оперізуючий лишай, Епштейн-Барр, цитомегаловірус), ВІЛ, віруси гепатиту (ВГВ та ВГС)
• діагностика та моніторинг бактеріальних інфекцій, особливо тих бактерій, які неможливо ідентифікувати за допомогою культур, наприклад туберкульозу
• діагностика та моніторинг новоутворень: лейкемія, рак молочної залози, колоректальний рак, рак легенів
• діагностика схильності до раку: рак молочної залози та яєчників (гени BRCA1 та BRCA2), колоректальний рак (гени APC та CHEK2)
• діагностика генетичних захворювань: гемохроматоз (ген HFE), таласемія (гени HBA1 та HBA2), целіакія (гени HLA)
• тести на батьківство, які виявляють ДНК-сумісність дитини та батька

Читайте також: Тести на хворобу Лайма - як вони виглядають і яка ціна на тести на хворобу Лайма Тест Western Blot та хвороба Лайма. Інтерпретація результатів тестів: хвороби, що передаються кліщем: хвороба Лайма, бабезіоз, бартонельоз, ТБЕ та інші.

В даний час існує багато модифікацій методу ПЛР. Наприклад, при діагностиці хвороби Лайма в основному використовуються методи вкладеної ПЛР та ПЛР у реальному часі. Останній є кількісним методом і дозволяє визначити точну кількість копій ДНК борелії в досліджуваному біологічному матеріалі.

ПЛР (дослідження) та хвороба Лайма

Серологічні тести є основою для діагностики хвороби Лайма. Однак існують клінічні ситуації, які можуть спричинити помилковий негативний результат цих тестів:

• серологічне вікно, тобто початковий період зараження, в якому організм ще не виробляє специфічні антитіла IgM та IgG проти спірохет боррелії
• у людей з імунодефіцитом, які не виробляють достатньої кількості антитіл
• наявність імунних комплексів, що складаються з антигенів боррелії та специфічних для них антитіл та запобігають виявленню антитіл за допомогою серологічних методів

Якщо у пацієнта є підозра на симптоми хвороби Лайма, а результати серологічних досліджень негативні, можна провести молекулярні тести на основі методу ПЛР.

ДНК спірохет боррелії можна виявити на ранній стадії зараження, оскільки кількість спірохет у рідинах організму тоді найбільша.

При діагностиці лайм-бореліозу в першу чергу застосовуються серологічні методи, такі як ІФА, але в деяких клінічних ситуаціях корисні генетичні тести з використанням методу ПЛР.

Чим довший час від зараження, тим менша ймовірність виявлення бактеріальної ДНК. Тому в деяких випадках перед проведенням ПЛР-дослідження бактерії вирощують на спеціальних середовищах протягом 1-2 тижнів, а потім проводять тест.

Цей підхід застосовується у разі підозри на хворобу Лайма та зібрану спинномозкову рідину. На пізній фазі зараження доцільніше проводити тест ІФА.

Метод ПЛР не слід використовувати для рутинної діагностики лайм-бореліозу через відсутність стандартизації щодо поширення сортів Borrelia burgdorferi у Польщі.

Однак у разі труднощів у діагностиці (особливо на ранній стадії захворювання) результат тесту ПЛР допомагає в процесі діагностики.

Позитивний результат тесту означає, що в досліджуваному матеріалі було виявлено наявність ДНК Borrelia burgdorferi та її різновидів, але це не пояснює, чи має місце активна інфекція в організмі. З іншого боку, негативний результат не виключає наявності бактерій в організмі.

Деякі лабораторії пропонують тестування на наявність ДНК борелії в кліщі. Однак результат такого обстеження не є підставою для діагностики хвороби Лайма у покусаної людини.

Рекомендована стаття:

Тест ІФА - що він виявляє? Як читати результати? Ціна тесту

ПЛР - результати. Чи можуть вони бути помилковими спрацьовуваннями?

ПЛР - це надчутливий метод і в той же час дуже чутливий до забруднення. Тому в тестах на основі ПЛР дуже важливо вибрати відповідний внутрішній контроль, щоб виключити помилкові спрацьовування.

Ключем також є правильний збір матеріалу для тестування, а також досвід та надійність діагностика, який проводить тест.

ПЛР - результати. Чи можуть вони бути помилково негативними

Як і в будь-якому лабораторному дослідженні, також у методі ПЛР можуть виявлятися помилково негативні результати. Тут важливо зібрати кров для відповідного антикоагулянта, оскільки деякі з них, такі як гепарин, можуть інгібувати реакцію ПЛР.

Також збір матеріалу після початку антибіотикотерапії може спричинити зниження ефективності реакції ПЛР та більшу ймовірність помилково негативних результатів.

Слід також пам’ятати, що бактерії боррелії дуже короткий час живуть у крові та рідинах тіла, оскільки завдяки спеціальним рецепторам вони дуже швидко проникають у «важкодоступні» місця в організмі.

Тому, на відміну від діагностики інших мікроорганізмів, кількість спірохет боррелії в біологічному матеріалі невелика, іноді навіть на межі виявлення методу ПЛР. Це також може спричинити помилковий негатив.

Рекомендована стаття:

Тест на перетворення лімфоцитів (LTT)

Література

1. Дунай Дж. Та ін. Значення методу ПЛР у діагностиці лайм-бореліозу. Перегляньте Епідеміол. 2013, 67, 119 - 123.
2. Лабораторна діагностика кліщових захворювань Рекомендації робочої групи: Національна палата лабораторних діагностиків, Національний інститут громадського здоров’я-Національний інститут гігієни, Національний консультант у галузі інфекційних хвороб, Департамент інфекційних хвороб та нейроінфекцій, Медичний університет у Білостоці, Польське товариство вірусологів, Варшава 2014.
3. Ružić-Sabljić E. та Cerar T. Прогрес у молекулярній діагностиці хвороби Лайма. Експерт Rev Mol Diagn. 2017 січня; 17 (1): 19-30.
4. Валонес М.А.А. та ін. Принципи та застосування полімеразної ланцюгової реакції в медичних діагностичних областях: огляд. Braz J Мікробіол. 2009 січень-бер; 40 (1): 1-11.

Про автора

Кароліна Карабін, доктор медичних наук, молекулярний біолог, лабораторний діагност, Cambridge Diagnostics Polska Біолог зі спеціалізацією з мікробіології та лабораторний діагност з більш ніж 10-річним досвідом у лабораторних роботах. Випускник Школи молекулярної медицини та член Польського товариства генетики людини, керівник наукових досліджень в лабораторії молекулярної діагностики при кафедрі гематології, онкології та внутрішніх хвороб Варшавського медичного університету. Захистила звання доктора медичних наук у галузі медичної біології на 1-му медичному факультеті Варшавського медичного університету. Автор багатьох наукових та науково-популярних праць у галузі лабораторної діагностики, молекулярної біології та харчування. Щодня, як фахівець у галузі лабораторної діагностики, він керує основним відділом Cambridge Diagnostics Polska та співпрацює з командою дієтологів у дієтичній клініці CD. Він ділиться своїми практичними знаннями з діагностики та дієтотерапії захворювань зі спеціалістами на конференціях, тренінгах, у журналах та на веб-сайтах. Її особливо цікавить вплив сучасного способу життя на молекулярні процеси в організмі.